ARTÍCULO ORIGINAL

Acción analgésica y neurofarmacológica de las fracciones soluble y no soluble del extracto etanólico de la semilla de Jatropha curcas L.

Analgesic and neuropharmacological activities of soluble and not soluble fractions of the ehtanolic extract from Jatropha curcas L. seeds

Alberto Salazar-Granara,^1,4 Sergio Goicochea-Lugo,^1,2,4 Ernesto Zavala-Flores,^1,2,4 Letícia Cazuza-Nascimento,^1,2,5 Elmer Luján-Carpio,^1,2,4 Carlos Pante-Medina¹

1. Centro de Investigación de Medicina Tradicional y Farmacología de la Facultad de Medicina Humana de la Universidad de San Martín de Porres (USMP). Lima, Perú.
2. Estudiante de Medicina Humana, Facultad de Medicina Humana de la USMP, Lima-Perú.
3. Estudiante de Medicina Humana, Facultad de Medicina Humana de la Universidad Federal de Campina Grande, Paraíba, Brasil.
4. Sociedad Científica de Estudiantes de Medicina de la Universidad de San Martín de Porres (Sociem-USMP).
5. Directorio Académico de Medicina Francisco Brasilero (DAFB).

Introducción. Estudios preclínicos evidencian efectos dosis dependiente sobre la analgesia e inflamación y neurotoxicidad de las hojas, corteza y raíz de J. curcas L. El propósito del estudio fue evaluar la actividad analgésica y neurofarmacológica de las fracciones de la semilla de J. curcas L. Métodos. Estudio experimental, preclínico y prospectivo. Se distribuyeron 48 ratones en seis grupos control: ácido acético, diclofenaco, tramadol, agua destilada, diazepam y cafeína. Cuatro grupos experimentales: fracción soluble a 500 mg/kg y fracción no soluble a 250, 500 y 750 mg/kg; se evaluó los efectos sobre la algesia, por medio de la prueba de contorsiones abdominales por ácido acético a 1,5 %, y las manifestaciones neurológicas, mediante la prueba de Irwin. Se realizaron pruebas para el análisis de las variables cuantitativas y para las variables cualitativas. Resultados. La inhibición de las contorsiones fue 62,27 %, 56,86 %, 44,12 % y 42,06 % para los grupos 5, 2, 4 y 3, respectivamente. Las manifestaciones neurológicas de los grupos experimentales mostraron presencia y significancia de las variables excitación, sacudidas de cabeza, rascarse, incoordinación motora, cola de Straub, piloerección y estereotipias. Las variables estereotipias y rascado se presentaron en las dos fracciones. Conclusión. La fracción soluble y la no soluble del extracto etanólico de J. curcas L. presentaron efecto analgésico y efectos tóxicos a nivel del sistema nervioso central.

Palabras clave: Jatropha curcas L.; semilla; analgesia; sistema nervioso central.

Introduction. Preclinical studies show the dose dependent effects on the analgesia, inflammation and neurotoxicity of the leaves, bark and root. The purpose of the study was to evaluate the analgesic and neuropharmacological activity of the fractions of the seed J. curcas L. Methods. Experimental study, preclinical and prospective. 48 rats were distributed in 6 control groups: acetic acid, diclofenac, tramadol, distilled water, diazepam, caffeine. Four experimental groups: 500 mg/kg of soluble fraction and 250, 500 y 750 mg/kg of insoluble fraction; the effects on the algesia were evaluated using an exam of abdominal contortions with acetic acid on 1,5%; the neurological manifestations were measured with the Irwin test. To analyze the quantitative and qualitative variables exams were used. Results. The inhibition of the contortions were 62,27 %, 56,86 %, 44,12 % y 42,06 % for the groups 5, 2, 4 y 3, respectively. The neurological manifestations of the experimental groups showed the presence and significance of the variables: excitation, head twitches, scratching, motor incoordination, Straub tail, piloerection and stereotypies. The variables stereotypes and scratching presented themselves in the two fractions. Conclusion. The soluble and insoluble fraction of the ethanoic extract of J. Curcas L. presented analgesic and toxic effects on the central nervous system.

Key words: Jatropha; seeds; analgesia; central nervous system.

Jatropha curcas L. (JcL) es una planta americana tropical dicotiledónea de la familia Euphorbiaceae, también conocida como piñón blanco, piñón, coquito, tempate, piñoncillo, entre otros. Es utilizado como biocombustible y planta medicinal.¹

En Perú es cultivada como planta ornamental en las regiones Cajamarca, Cusco, Loreto, Piura y San Martín, por lo que podrían estar usando esta planta sin conocer sus posibles efectos adversos; sin embargo, sí se conocen sus usos medicinales tradicionales de las hojas para enfermedades reumáticas, de los cogollos para enfermedades diarreicas, del látex para ulceras, conjuntivitis, odontalgias, antisepsia, heridas y cáncer de tipo inicial y de las semillas en estreñimiento. Se han hallado diversos compuestos químicos, en su corteza (citrasterol y triterpenos), en las hojas (heterósidos, cianogénicos y flavónicos); y en las semillas (taxoalbúmina).¹

En ensayos de laboratorio con ratones se encontró potente actividad antimicrobiana contra E. coli, Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa, Neisseria gonorrhoeae, Staphylococcus aureus y Aspergillus flavus,² poder antiinflamatorio de la raíz,³ además, se encontró actividad antifúngica del extracto etanólico de las semillas⁴ y que también servían al ser usadas con aplicaciones agrícolas.⁴

Existen pruebas diseñadas para evaluar modelos de dolor visceral en ratones como la prueba de Writhing o de contorsiones abdominales (CA) por ácido acético (AA);⁵ y para evaluar la acción neurofarmacológica de una sustancia en busca de sus posibles efectos tóxicos, sobre el comportamiento y sobre el sistema nervioso (SN) como la prueba de Irwin.⁶ Adicionalmente se cuentan con antecedentes de su utilidad en trabajos preclínicos.^7-9

El último plan estratégico de la OMS sobre Medicina Tradicional señala que a pesar del gran desarrollo e implementación de leyes en varios países sobre el uso de plantas medicinales todavía faltan investigaciones que demuestren el potencial total de cada planta y sus efectos benéficos y adversos que estas pueden tener.¹⁰

Teniendo en cuenta estos antecedentes, el presente trabajo de investigación dará resultados sobre los efectos analgésico y neurofarmacológico de la fracción soluble (FS) y la fracción no soluble (FNS) de JcL para que de esta forma se den a conocer sus propiedades de manera integral a la comunidad médica y así como también a la población.

Estudio experimental, preclínico, prospectivo; realizado en el Centro de Investigación de Medicina Tradicional y Farmacología, de la Facultad de Medicina Humana, de la Universidad de San Martín de Porres (FMH-USMP); en el periodo setiembre a diciembre del año 2013.

Se emplearon semillas secas de JcL, recolectadas en Tarapoto, San Martín, bajo la certificación taxonómica de los criterios del método Cerrate E.¹¹

La población de estudio fue 48 ratones albinos hembras, cuyos pesos oscilaron entre 25 y 30 gramos, adquiridos en el Instituto Nacional de Salud (Bioterio INS, Chorrillos, Lima, Perú); asimismo, pasaron un proceso de aclimatación en las instalaciones del Bioterio de la FMH-USMP, en condiciones estándares de niveles de temperatura de 22ºC (+2), humedad relativa promedio entre 45 % y 70 %, y niveles de ruido menores a 70 dB. Para la distribución y asignación aleatorizada de los grupos experimentales se empleó el método por sorteo.¹²

AA glacial 100 %, frasco ACS-ISO-Merck, solución al 1,5 %, R 10-35, S 232645; tramadol ampollas de 50 mg/mL, lote 103022, RS N-20715, vencimiento marzo de 2017; diclofenaco sódico, ampollas de 75 mg/3 mL, lote 2121638 RS N-20715, vencimiento diciembre de 2014; agua destilada.

El extracto se preparó a partir del material seco y molido de la semilla del JcL, este se maceró durante una semana en etanol al 70%, posteriormente la mixtura fue filtrada, mediante un filtro Whatman de 1,6 a 1,2 mm; el residuo obtenido fue secado en una estufa por un periodo de 7 días. La muestra secada fue molida en el mortero hasta obtener un polvo muy fino, el cual se almacenó en envases herméticos y en refrigeración hasta su uso experimental.¹³

A partir del extracto etanólico se preparó una solución al 10% con agua destilada, esta fue llevada a una cámara de ultrasonido Branson 5510, la cual trabaja con una frecuencia de 40 kHz, 100 W de poder y a una temperatura de 25 °C. Donde permaneció por 45 minutos a 3 000 rpm, hasta lograr una solución homogénea, la que se empleó para los fines de experimentación.

A partir del extracto etanólico, se preparó una solución al 10% con agua destilada, esta fue llevada a una cámara de ultrasonido Branson 5510 (frecuencia de 40 kHz, 100 W de poder y a una temperatura de 25 °C), donde permaneció por 45 minutos, a 3 000 rpm, hasta lograr un solución homogénea; seguidamente, fue filtrada utilizando papel filtro Whatman de 0,5 a 0,1 mm, el residuo obtenido fue secado en una estufa por un periodo de 7 días. La muestra secada fue molida en el mortero hasta obtener un polvo muy fino; con este, se preparo una solución al 10 % con agua destilada, esta fue llevada nuevamente a la cámara de ultrasonido, donde permaneció por 45 minutos a 3 000 rpm, hasta lograr una solución homogénea, la que se empleo para los fines de experimentación.

Estas soluciones, permitieron la aplicación de volúmenes adecuados de las sustancias problemas, según la vía de administración empleada, en base a las recomendaciones estándares recopiladas del Handbook of laboratory animal science.¹⁴

Se utilizó la prueba de Writhing.⁵ 24 horas antes del inicio del experimento, se privó de alimentos a los roedores, y se continuó con agua ad libitum. Posteriormente, se administró vía oral (VO) las fracciones de JcL una hora después de esto, se administró AA glacial solución al 1,5 %, 0,1 mL/10 g, vía Intraperitoneal (IP), luego durante 15 minutos se procedió a cuantificar el número de CA realizadas por los roedores. Posteriormente, se sacrificó a los animales por dislocación cervical.

Se aplicó la prueba de Irwin,⁶ considerando la evaluación de la primera hora, de la prueba. Este consistió en la observación de manifestaciones neurológicas en el ratón, después de la administración de la sustancia problema. Los ítems analizados, catalogados como presencia o ausencia, fueron los siguientes: letalidad, convulsiones, cola de Straub, sedación, excitación, marcha anormal (en círculos o en puntas de pie), saltos, incoordinación motora, piloerección, estereotipias (oler, masticar, o movimientos de cabeza), CA, sacudidas de cabeza, escozor y alteración de la respiración.

Los grupos experimentales fueron conformados por 6 ratones, distribuidos en ocho grupos, de la siguiente forma: grupo 1: 0,1 mL/10 mg de AA vía IP; grupo 2: fracción B de extracto etanólico de JcL 500 mg/kg VO; grupos 3, 4, 5: fracción A de extracto etanólico de JcL 250, 500 y 750 mg/kg VO, respectivamente; grupo 6: 0,1 mL/10 mg agua destilada VO; grupo 7: tramadol 10 mg/kg VO; grupo 8: diclofenaco sódico 10 mg/kg VO.

Se respetó los principios y los lineamientos para las investigaciones en animales de laboratorio, referidos en El Comité de Ética para el Uso de Animales (CIEA), UPCH¹⁵ y el Comité de Institucional de Ética para el uso de animales en investigación - INS⁽¹⁶⁾. Además, el estudio fue aprobado por el Instituto de Investigación de la Facultad de Medicina Humana de la Universidad de San Martín de Porres.

El análisis estadístico de los datos cuantitativos se efectuaron aplicando las siguientes pruebas: test de Kolmogorov-Smirnov, test de ANOVA y los test de Newman-Keuls y Tukey para las comparaciones entre los grupos; se estableció la significancia estadística, para un valor p < 0,05, y la estimación de parámetros estadísticos mediante intervalo de confianza (IC) al 95 % de probabilidad de confianza. La variación entre las dosis y los efectos, se analizó a través del coeficiente de correlación de Pearson. Los datos cualitativos se analizaron aplicando la prueba exacta de Fisher. Se empleó como soporte informático Microsoft Office Excel 2010 y el programa estadístico GraphPadPrism Versión 5.01, para la aplicación de las pruebas estadísticas mencionadas.

En la Tabla 1 se muestran los datos descriptivos acerca del número de CA de todos los grupos experimentales. La prueba de Kolmogorov-Smirnov determinó que el tipo de distribución de los grupos experimentales fue Gaussiana o paramétrica (p > 0,05).

La prueba de ANOVA mostró un valor p < 0,05 (p = 0,0077). Las pruebas de pareo de Tukey y Newman-Keuls, mostraron un p < 0,05 entre el grupo 1 versus los grupos 2 al 8 (Tabla 1).

La Figura 1 presenta el porcentaje de inhibición de las CA de los grupos experimentales: 62,27 %, 56,86 %, 44,12 % y 42,06 % para los grupos 5, 2, 4 y 3, respectivamente.

La prueba de correlación de Pearson no resultó en dosis-efecto; sin embargo, mostró una correlación general inversamente proporcional respecto al número de CA (r = -0,1893) (p = 0,4519), con un coeficiente de determinación r²= 0,035 (Figura 2).

Con respecto a la evaluación primaria neurofarmacológica, las variables de letalidad y convulsiones no fueron tomadas en cuenta al momento de hacer el análisis ya que no presentaban valores de presencia. Las variables marcha anormal, salta y retorcijones abdominales no fueron incluidas en la Tabla 2, ya que no presentaban significancia estadística en ninguno de los grupos experimentales.

En los grupos experimentales, las variables excitación, sacudidas de cabeza, rascarse, incoordinación motora, cola de Straub, piloerección y estereotipias mostraron presencia y significancia.

El análisis de las variables cualitativas se detalla en la Tabla 2. La variable estereotipias se presentó a todas las dosis de las FS y FNS y la variable rascado, en las dos fracciones pero no en todas las dosis. Además, el grupo que presentó la mayoría de efectos fue el de la FNS de JcL a 250 mg/kg.

La acción analgésica y antiinflamatoria de las hojas, corteza y raíz de la JcL ha sido ampliamente descrita por diversos autores.^17,18 Esta acción se atribuye principalmente a la presencia de flavonoides y alcaloides similares a la galantamina.¹⁹ En contraste a ello, no se encuentran publicaciones utilizando las semillas para evaluar dichas acciones.

El método de evaluación analgésica de CA por AA, imbrinca componentes algogénicos de nocicepción y de inflamación;⁵ por esto, es posible que postula que en los resultados se evidenciaron efectos de carácter antiinflamatorio y analgésico, el cual no depende de la dosis de administración de la JcL (Figura 1), hecho que corrobora lo estipulado por Pabón y col.¹⁷

La dosis de 750 mg/kg de la FNS y la de 500 mg/ kg de la FS presentaron el mayor porcentaje de inhibición de las contorsiones con respecto al grupo de AA y no fueron significativos respecto al tramadol ni al diclofenaco, por lo que es posible plantear un efecto tipo opioide y antiinflamatorio.

Este resultado podría deberse a la presencia de los esteroles en el extracto etanólico de la semilla,²⁰ de los cuales se han descrito sus propiedades antiinflamatoria, antipiréticas y análogos a la hidrocortisona.²¹ Producto de lo descrito anteriormente disminuiría la sensibilización de las fibras C amielínicas y fibras A delta mielínicas, encargadas de la transmisión del dolor,²² contribuyendo de esta manera a la acción analgésica.

Se postula que la acción analgésica también podría deberse a la acción del β-sitosterol, presente en estudios fitoquímicos de la semilla,²⁰ pues Abdul-Wahab et al., y Sangeetha y et al. describieron su efecto similar a los opioides. En adición, Nirmal y otros investigadores concluyeron que podría actuar como secretagogo de opioides endógenos.^23-25

Así mismo, se han revelado la presencia de terpenos en la semilla de JcL,²⁰ de los que se han descrito su acción sobre el factor nuclear NF-kb, involucrado en la analgesia del dolor crónico en enfermedades reumáticas.²⁴

También se ha propuesto la participación de otros metabolitos descritos en los estudios fitoquímicos de la JcL como las saponinas, aterospermidina y alcaloides similares a la galantamina, pues actuarían sobre la ciclooxigenasa (COX) y sobre la concentración intracelular de calcio.^26,27

Cabe mencionar que tanto en la FS como en la FNS se observó el efecto de inhibición de las CA, por lo que posiblemente los metabolitos responsables de esta acción se encuentre en las dos soluciones y quizá influya también el tamaño de estos metabolitos. Esto también fue planteado por Sangeetha et al., quienes estudiaron el efecto antiinflamatorio de los extractos de la corteza de JcL.²⁵

Con respecto a la evaluación primaria mediante el test de Irwin, se encontraron manifestaciones adversas y neurotóxica en los grupos experimentales, tales como estereotipias, rascado, cola de Straub, piloerección, excitación, incoordinación motora y sacudidas de cabeza.

Tanto la FS como la FNS presentaron estereotipias, lo que traduce un efecto estimulante a nivel del SN central, debido posiblemente a la presencia de algún fitoquímico estimulante de receptores dopaminérgicos, como lo plantearon Zavala-Flores et al.²⁸ Por otra parte, ante la presencia de efectos en el SN central, se plantea que el o los metabolitos secundarios serían los responsables de estos y de la inhibición de las CA, infiriendo moléculas altamente liposolubles.²⁸

Reforzando el efecto estimulante central y periférico, se presentaron rascado y cola de Straub. Esto podría explicarse mediante la presencia, en la planta, de una sustancia con efecto similar a la galantamina,¹⁹ la cual tendría efecto sobre la acetilcolinesterasa. Consecuentemente se incrementarían los niveles de acetilcolina.^19,29

Adicionalmente, la estimulación colinérgica explicaría la presencia de la piloerección,^29,30 la cual es equivalente a la sudoración en humanos, por lo que altas dosis posiblemente conllevarían a la deshidratación por diaforesis, planteando la posibilidad de una potencial actividad colinérgica.^19,29

La incoordinación motora traduciría ataxia, y permite plantear su posible acción a nivel cerebelar y cerebral. En ella estarían implicados los efectos tipo opioide y sobre los receptores dopaminérgicos como han sugerido Koek et al.³¹ Con ello también se podría explicar la manifestación de sacudida de cabeza.

A lo antes dicho, se podría agregar la posibilidad de que metabolitos presentes en JcL, posiblemente atraviesen la barrera hematoencefálica,³² dando pie a las manifestaciones antes descritas al SN. Además, por su liposolubilidad podrían atravesar otras barreras biológicas, como la hematoplacentaria, deviniendo en efectos teratogénicos.³³

Una de las principales limitaciones del estudio, es que los resultados no delimitan con exactitud el sitio de acción y el nivel molecular de acción. Ello genera la recomendación de nuevas investigaciones en estos niveles.

Estos resultados demuestran posibles efectos dañinos para la salud del consumidor de esta semilla. Se recomienda realizar estudios donde se evalúen la toxicidad de la semilla, en especial de los fitoquímicos más abundantes de esta semilla.

La fracción soluble y la no soluble del extracto etanólico de J. curcas L. presentaron efecto analgésico, posiblemente a nivel central y periférico. Las fracciones presentaron efectos tóxicos a nivel del sistema nervioso central.

A los doctores Frank Lizarazo Caparó, Benjamín Castañeda Castañeda y Berta Loja Herrera. Al Mg. Ángel Alvarado Yarasca y al técnico Carlos Pante Medina. A la Sociedad Científica de Estudiantes de Medicina, Universidad de San Martín de Porres.

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Financiamiento
Cofinanciamiento por la Facultad de Medicina Humana de la Universidad de San Martín de Porres y los autores.

Correspondencia
Alberto Salazar-Granara: alberto.salazar@gmail.com
Sergio Goicochea-Lugo: chey_ht@hotmail.com

Fecha de recepción: 5 de setiembre de 2014.
Fecha de aceptación: 25 de setiembre 2014.