Artículo original
Dosis-respuesta sobre la motilidad intestinal y el sistema nervioso de la interacción entre Jatropha curcas L. y metoclopramide
Intestinal motility andnervous system effects dose-response curvefor the interaction between Jotropha curcas L. and metoclopramide
Zavala-Flores Ernesto1 , Goicochea-Lugo Sergio1 , Agurto-Muñóz Thalia1 , Adrianzen-Rodriguéz Sandra1 , Coronel-Bustamante Gianmarco1 , Salazar-Granara Alberto1 .
1. Centro de Investigación de Medicina Tradicional y Farmacología de la Facultad de Medicina Humana de la Universidad de San Martín de Porres. Lima, Perú.
RESUMEN
Objetivo: Determinar el efecto dosis-respuesta sobre la motilidad intestinal y el sistema nervioso, de la interacción entre el extracto etanólico de las semilla de J. curcas L. y metoclopramida.
Métodos: Se utilizaron 90 ratones albinos,formando 10 grupos de interacción que recibieron por vía oral (VO), en dosis establecida metoclopramida 0,5 mg/kg y en dosis escalonada extracto etanólico de la semilla de J. curcas L. (100 a 1000 mg/kg). Otros 5 grupos recibieron por VO, 0,5 mg/kg de metoclopramida; 1,5mg/kg de atropina; 800mg/kg de J. curcas L., 0,1ml/10g de agua destilada y el último grupo no recibió medicamento. A todos los grupos, se les administró vía oral carbón activado al 5 %, 0,1ml/10 g, como marcador intestinal. Se empleó el Método de Arbos et al, para evaluar la motilidad intestinal y la prueba de Irwin para el sistema nervioso. La validación estadística del recorrido intestinal se realizó aplicando las pruebas de Shapiro-Wilk, ANOVA de 1 cola, Tukey, Newman-Keuls, Kruskal-Wallis y correlación de Pearson. Para la prueba de Irwin se aplicó la prueba de Chi-cuadrado corregido de Yate y el estadístico exacto de Fisher.
Resultados: Se observó un porcentaje de recorrido del carbón de 56,8%, 34,54%, 31,85% y 24,57%, en los grupos de interacción 2, 7, 8, 9 y 10 respectivamente, frente a 56,3% (metoclopramida) y 27,66% (control). El Test de Irwin denotó piloerección, sedación, aumento de la respiración y letalidad.
Conclusiones: Se comprobó el antagonismo entre el extracto etanólico de la semilla de J. curcas L. con la metoclopramida, y la ocurrencia de manifestaciones en el sistema nervioso.
Palabras claves: Metoclopramida, Jatropha curcas L., motilidad gastrointestinal, toxicidad, sistema nervioso, dosis-respuesta. (DeCSBIREME).
SUMMARY
Objectives: Determinate the dose–response relationship with respect to intestinal motility and the nervous system, of the interaction between the ethanol extract of the J. curcas L. seed and metoclopramide
Methods: 90 albino mice were used, which were divided into 10 interaction groups that received 0.5 mg Kg oral (PO) metoclopramide as a fixed dose, and they also received progressively increased doses (100 to 1000 mg/Kg) of an ethanol extract of J. curcas L. seeds. Five additional groups received 0.5 mg metoclopramide PO, 1.5 mg/Kg atropine, 800 mg/Kg J. curcas L., and 0.1 ml/10g distilled water. All groups received oral 5% activated charcoal, 0.1 ml/10g as an intestinal marker. We used the technique described by Arbos et al. for assessing intestinal motility and Irwin's test for assessing the nervous system. The statistical validation of intestine dynamics was performed using Shapiro-Wilk, 1-tailed ANOVA, Tukey, Newman-Keuls, Kruskal-Wallis and Pearson correlation tests. We used the Chi-square method with Yates correction and Fisher's exact method when performing Irwin's test.
Results: The percentages of charcoal runs in the 2nd, 7th, 8th, 9th, and 10th interaction groups were 56.8%, 34.54%, 31.85 and 24.57%, compared to 56.3% (metoclopramide) and 27.66% (control). The Irwin test showed these neurological effects: piloerection, sedation, increased respiratory rate and lethality.
Conclusions: We proved there is antagonism between the ethanol extract of J. curcas L. seeds and metoclopramide. We also found the concomitant occurrence of neurotoxic effects.
Keywords: metoclopramide, Jatropha curcas, gastrointestinal motility, toxicity, nervous system, dose-response (MeSH).
INTRODUCCIÓN
Jatropha curcas L, (fotos 1, 2)- es una planta conocida con los nombres comunes de: Piñon, Piñoncito, Piñol, Higos del duende, Barbasco, Piñones purgativos, Periyanasi (piro); Piñón joshó (amahuaca); Wapa-wapa oshe (ese eja); Josho pionis y Huiso pionis (shipiboconibo), Peaó branco (portugués); Higo de infierno (Bolivia); Purga de fraile (Colombia), Tua tua (Venezuela); Sket'noto (Surinam).
En la actualidad, en el Perú, se reconocen los siguientes usos medicinales tradicionales de la semilla molida o cruda de Jatropha curcas L: purgante, antirreumático, analgésico, antiulceroso, usos tópicos en conjuntivitis y como antiséptico y cicatrizante vaginal1 . Por otra parte, existen reportes de series de casos en humanos con intoxicación por consumo de Jatropha curcas L., presentando efectos como náuseas, vómitos, diarrea y dolor abdominal2, 3 .
En contraste, las investigaciones pre-clínicas han demostrado la actividad anti-fértil, antimicótica y acaricida de las semillas4 ; así mismo, estudios de la raíz le infieren actividad anti-diarreica, antiinflamatoria5 , cicatrizante, efecto abortivo, coagulante y anticoagulante del látex6 y letalidad7,8
Los efectos biológicos reconocidos de la semilla de Jatropha curcas L. son respaldados por sus metabolitos secundarios, a la actualidad se conoce que presenta alcaloides, flavonoides, esteres, lectinas, entre otros9 .
Considerando la distribución geográfica de Jatropha curcas L. en el Perú (Lima, Piura, Cajamarca, San Martín, Cusco, Ucayali y Loreto) es posible que la población esté consumiendo esta planta conjuntamente con medicamentos comunes, sin estar advertida de los potenciales riesgos, hasta la muerte, que podría ocasionar.
Esta práctica con otras plantas, ha revelado efectos deletéreos en el hombre, por ejemplo: el aumento de riesgo de rechazo a trasplantes tras la ingesta de Hypericum perforatum L. (Hierba de San Juan) y ciclosporina10 , así como efectos a nivel central con el uso concomitante de flufenacina y aceite de onagro (Oenothera biennis ) que disminuye el umbral convulsivo11 .
Por otra parte, existen métodos validados que permiten evaluar el efecto de un medicamento o de una planta medicinal sobre la motilidad gastrointestinal y el sistema nervioso, como la prueba de Arbos et al y de Irwin, respectivamente (12,13).
Este estudio se centró en evaluar la interacción farmacológica sobre la motilidad intestinal y el sistema nervioso, el extracto etanólico de la semilla de Jatropha curcas L. (a dosis escalonadas) y la metoclopramida (en dosis fija) en el ratón albino macho.
MATERIALES Y MÉTODOS
Tipo de estudio, espacio y temporalidad. Estudio cuasi-experimental, pre-clínico, prospectivo y doble ciego; realizado en el Centro de Investigación de Medicina Tradicional y Farmacología de la Facultad de Medicina Humana de la Universidad de San Martín de Porres (FMH-USMP); durante el periodo julio a noviembre del año 2012.
Muestra vegetal. Se utilizó semillas secas de Jatropha curcas L, las cuales fueron recolectadas en Tarapoto - San Martín. La certificación taxonómica se realizó bajo los criterios del método de Cerrate E,196914 .
Muestra biológica. La población de estudio estuvo conformada por 90 ratones albinos machos, cuyos pesos oscilaron entre 25 y 30 gramos. Éstos se adquirieron en el Instituto Nacional de Salud (INS – Bioterio, Chorrillos, Lima – Perú); asimismo, pasaron un proceso de aclimatación en las instalaciones del Bioterio de la FMHUSMP, en condiciones estándares de niveles de temperatura de 22ºC (+/-2), humedad relativa promedio entre 45 a 70% y niveles de ruido menores a 70 dB.
Fueron aislados en jaulas con libre acceso a agua y se les proporcionó alimento balanceado. Para la distribución y asignación randomizada de los grupos experimentales se empleó el método por sorteo15 .
Muestra química. Atropina, ampollas de 25 mg/1ml, lote 101010 RS NG-3587, vencimiento 01/2014; Metoclopramida, ampollas de 10mg/2ml, lote EL- 395038 RS EJE-5610, vencimiento 04/2013; Carbón activado, lote 0000097644; Agua destilada.
Preparación del extracto etanólico. Se realizó a partir de 20 gr de semillas molidas de Jatropha curcas L. maceradas en etanol al 70% durante una semana, aplicando ciclos de sacudidas de una hora.
Posteriormente, fue filtrado y los residuos fueron secados en una estufa por 5 días. Luego se extrajeron muestras mediante raspado y se almacenaron en envases herméticos a refrigeración para su uso posterior. Las soluciones administradas en las experiencias de estudio, presentaron una concentración de 10 y 20%, éstas se prepararon de la siguiente forma: al 10% consistió en combinar la muestra de J. curcas L. con 5 ml de etanol al 70%, diluyéndose en una plancha caliente con agitador de marca CIMAREC, a una temperatura de 37°C, por 3 minutos; seguidamente, se agregó agua destilada hasta completar 100 ml de solución. Al 20%, se siguió el mismo procedimiento, con la diferencia que se agregó 2 ml de etanol al 70% y 3 ml de cloroformo GP. Estas soluciones, permitieron la aplicación de volúmenes adecuados de las sustancias problemas, en base a las recomendaciones estándares recopiladas del Handbook of laboratory animal science16 .
Evaluación de la motilidad gastrointestinal in vivo. Se utilizó el método de Arbos et al . 199312 . A 24 horas antes del inicio del experimento, se privó de alimentos a los roedores, y se continuó con agua ad libitum .
Posteriormente, se administraron las sustancias en estudio. Transcurridos 30 minutos, se procedió a administrar por vía oral (VO) el marcador carbón activado al 5% a dosis de 0.1 ml/10 gr de peso. Luego de 30 minutos, se sacrificó a los animales por dislocación cervical, realizándose disección tipo laparotomía para extraer el intestino delgado, desde la porción pilórica hasta el colon, y se procedió a medir la distancia recorrida del carbón activado (que contuvo por lo menos 1 cm continuo de carbón) entre la porción pilórica y la unión ileocecal. La distancia se expresó como la media del porcentaje de la longitud total del intestino recorrida por el carbón ± error estándar.
Evaluación primaria neurofarmacológica por medio del Test de Irwin. Se aplicó el Test de Irwin13 , considerando la evaluación de la primera hora de la prueba. Éste consistió en la observación de manifestaciones neurológicas en el ratón, después de la administración de una sustancia. Los ítems analizados, catalogados como presencia o ausencia, fueron los siguientes: letalidad, convulsiones, cola de Straub, sedación, excitación, marcha anormal (en círculos o en puntas de pie), saltos, incoordinación motora, piloerección, estereotipias (oler, masticar, o movimientos de cabeza), contorsiones abdominales, sacudidas de cabeza, escozor y alteración de la respiración.
Diseño de grupos experimentales. Los grupos experimentales fueron conformados por 6 ratones, distribuidos en 15 grupos, de la siguiente forma: grupos de Interacción del 1 al 10, que recibieron Jatropha curcas L. a dosis escalonada entre 100 y 1000 mg/kg, y metoclopramida a dosis establecida de 0,5 mg/kg. Grupo 11: 0,5 mg/kg de metoclopramida. Grupo12: 1,5 mg/kg de atropina. Grupo 13: 800 mg/kg de Jatropha curcas L. Grupo 14: 0,1 ml/10g de agua destilada. Grupo 15: no se le administró sustancia farmacológica, solo recibió carbón activado (control negativo)
Sistema de ciegos. Para los datos cuantitativos se aplicó un sistema de doble ciego. En el primer sistema, dos personas se encargaron de la medición de la longitud total del intestino y del recorrido del carbón activado, sin saber a cuál grupo pertenecían estas muestras. En el segundo sistema, otros dos experimentadores se encargaron de procesar los datos obtenidos al software estadístico, sin conocer a qué grupos pertenecían. Para la parte cualitativa, se utilizó el mismo procedimiento descrito en el segundo sistema de ciegos17.
Ética e investigación. Se respetó los principios y los lineamientos para las investigaciones en animales de laboratorio, referidos por las International Guiding Principles for Biomedical Research Involving Animal (1985), el Comité de Ética para el Uso de Animales (CIEA) – UPCH (18) y el Comité Institucional de Ética para el uso de animales en investigación – INS19.
Análisis estadísticos. La validación estadística de los datos cuantitativos se efectuaron aplicando las siguientes pruebas: Shapiro-Wilk, ANOVA de 1 cola, Kruskal- Wallis, Newman-Keuls y Tukey; se estableció la significancia estadística, para un valor p<0,05, y un intervalo de confianza al 95%. La variación entre las dosis y los efectos, se analizó a través del coeficiente de correlación de Pearson. Los datos cualitativos, se validaron, aplicando las pruebas de Chi cuadrado corregido de Yate y Fisher. Se empleó como soporte informático Microsoft Office Excel 2010 y el programa estadístico Graph Pad Prism Versión 5.01.
RESULTADOS
En la Tabla 1 se muestran los datos descriptivos acerca de la motilidad intestinal de todos los grupos experimentales. La prueba de Shapiro-Wilk determinó que el tipo de distribución de los grupos experimentales fue Gaussiana o paramétrica (p>0,05 IC 95 %), excepto para los grupos 3 y 12 (p=0,013 IC 27,64 a 44,84 y p=0,025 IC 7,85 a 27,88) (Tabla 1).
Para grupos que mostraron una distribución Gaussiana, la prueba de ANOVA de una cola arrojó un valor p<0,05. Las pruebas de pareo de Tukey y Newman-Keuls, mostraron un p<0,05 entre los siguientes grupos: grupo 2 versus grupos del 7 al 10, 12 y 15; grupo 11 versus grupos del 7 al 10, 12 y 15 (Tabla 1).
En los grupos de interacción, la prueba de correlación de Pearson resultó en dosis-efecto, mostrando una correlación general inversamente proporcional respecto a la motilidad intestinal (r = -0,27) (p=0,003 IC 95% -0,43 a -0,095), con un coeficiente de determinación r2=0,07 (Figura 3).
Con respecto a la evaluación primaria neurofarmacológica, frente al grupo control, se encontró presencia de piloerección en los grupos 4 y 9 (p<0,05), FI sedación en el grupo 6 (p<0,05), letalidad en el grupo 10 (p>0,05) y respiración aumentada en el grupo 11 (p>0,05) (Tabla 2).
DISCUSIÓN
Estudios preclínicos demostraron el efecto procinético intestinal del extracto etanólico y del pool de alcaloides de la semilla de J curcas L.20, 21 ; actividad farmacológica corroborada en la presente investigación. Ver Tabla 1.
Los posibles mecanismos moleculares que explicarían esta actividad, pueden deberse a que J curcas L. posee alcaloides como la galantamina, metabolito con efecto anticolinesterásico, agonista nicotínico, secretagogo de serotonina y agonista de receptores muscarínicos 22, 23 .
Otra probable vía para estimular la motilidad intestinal, es por acción de los flavonoides y los ésteres de forbol presentes en J curcas L, al producir aumento en la concentración del AMPc (adenosina mono fosfato cíclico) y de calcio intracelular respectivamente24,25 .
Asimismo, en este estudio se corroboró la estimulación de la motilidad intestinal, producida por la metoclopramida, la cual es mediada por agonismo de receptores serotoninérgicos 5-HT4 y antagonismo de receptores dopaminérgicos D2 26 .
En contraste, se observó que los grupos de interacción inhibieron la motilidad intestinal, lo cual sugiere un mecanismo de antagonismo, correlacionado con dosis escalonadas de Jatropha curcas L , siendo más pronunciados en los grupos 7, 8, 9 y 10 (Tabla1).
Tomando en cuenta el mecanismo de acción de metoclopramida26 y lo descrito para J curcas L22-26 , es posible que el antagonismo observado se deba a un incremento de acetilcolina (Ach) en la sinapsis de los ganglios y la médula suprarrenal, deviniendo en descargas de catecolaminas y agonismo sobre receptores β 3 y β 2 en el tracto gastrointestinal27, 28 .
Otra posibilidad es que la Ach pudiera estar activando receptores M3 gástrico y pilórico y M1 gástrico e intestinal, conllevando directamente e indirectamente, a la disminución del vaciamiento gastrointestinal29-33 . Adicionalmente, existen estudios que demuestran que el alcaloide atherospermidine, presente en Jatropha curcas L , regula la concentración de calcio citoplasmático y relaja el músculo liso uterino3 4 , 3 5 ; asimismo, investigaciones de la hoja y la corteza de la planta comprueban la regulación de la producción de óxido nítrico36 , ambos efectos podrían explicar el antagonismo entre estas sustancias.
Otra teoría, que podría explicar el antagonismo farmacológico, es el posible efecto inductor de J curcas L . a nivel de la enzima citocromo P450, responsable de la biotransformación de la metoclopramida37 , hipótesis basada en estudios de flavonoides y alcaloides que demostraron actividad inductora en este sistema38-42 . A lo mencionado anteriormente, se suma la posibilidad de que los flavonoides presentes en J curcas L . posean efectos moduladores sobre receptores ionotrópicos GABA y receptores de adenosina, efectos demostrados en estudios previos43, 44 .
Se plantea la posibilidad de que algún componente de J curcas L . pudiera haber actuado como un agonista parcial de los receptores dopaminérgicos D2 y por competición con metoclopramida se produce disminución de la motilidad intestinal, teoría sustentada en la afinidad de flavonoides sobre estos receptores43,45 .
Por otra parte, el estudio de Zavalaga-Noriega D. 21 demostró que la dosis escalonada de la semilla de J curcas L . ejerce un efecto directamente proporcional en la motilidad intestinal; en contraste, en este mismo estudio, en los grupos de interacción se observó una correlación
inversa, evento que suma a la hipótesis de posibles antagonismos entre las sustancias estudiadas. Acerca del test de Irwin, en esta investigación se reveló que las interacciones generaron efectos adversos y neurotóxicos a nivel del sistema nervioso, estos fueron: piloerección, sedación, aumento de la respiración y letalidad. Ver Tabla 2.
Los efectos neurotóxicos observados podrían deberse a que los metabolitos secundarios presentes en J curcas L . atraviesen la barrera hematoencefálica46 . Es posible que estos metabolitos sean altamente liposolubles y, por lo tanto, podrían atravesar otras barreras biológicas, como la hemato-placentaria, lo que podría conllevar a efectos teratógenos47 .
La piloerección que se presentó en los grupos de interacción (Tabla 2), es el equivalente a sudoración en humano e indica una posible actividad a nivel neurovegetativo, la cual podría deberse a un incremento de la Acetilcolina en las sinapsis efectoras, por mecanismos citados en los párrafos previos22-26 .
Otra manifestación que se presentó en los grupos de interacción fue sedación, la cual expresa una inhibición cortical del sistema nervioso central, hecho que podría sustentarse en la afinidad de los metabolitos secundarios de J curcas L . por receptores GABA y en la ausencia de este efecto por la metoclopramida43, 44 (Tabla 2). También se presentó un caso de letalidad en un grupo de interacción (Tabla 2). El posible origen de esta reacción, podría basarse en los ésteres de forbol presentes en J curcas L . del cual se ha demostrado toxicidad en animales y en humanos25, 48 .
Otro evento en los grupos de interacción fue el aumento de la respiración (Tabla 2), por lo que es probable que se haya presentado una actividad a nivel del tronco encefálico49,50 ; sin embargo, estas especulaciones deberán dilucidarse en futuros estudios.
Una de las principales limitaciones de este estudio es que los resultados no delimitan con exactitud el sitio ni el nivel molecular de acción en los sistemas biológicos explorados. Ello genera la recomendación de nuevas investigaciones en estos niveles.
Del mismo modo, los efectos neurotóxicos observados presentan la limitación de una aplicación parcial de la prueba de Irwin; por ello, es posible que existan otros efectos neurotóxicos ante exposiciones prolongadas, lo cual deberá dilucidarse en próximas investigaciones.
Considerando la interacción farmacológica demostrada, es relevante alertar sobre las potenciales interacciones con el uso concomitante de medicamentos con efectos similares43 .
Asimismo, los hallazgos de este estudio suman J. curcas L. a la lista de plantas medicinales que presentan interacciones con medicamentos, con desenlaces adversos y tóxicos, lo que promueve indicar a la comunidad el uso racional de la Medicina Tradicional.
CONCLUSIONES
- Se demostró el efecto de antagonismo farmacológico sobre la motilidad intestinal, entre el extracto etanólico de la semilla de J curcas L . y metoclopramida.
- La interacción farmacológica entre el extracto etanólico de la semilla de J curcas L . y metoclopramida, presentó los siguientes efectos adversos y/o tóxicos a nivel del sistema nervioso central: piloerección, sedación, aumento de la respiración y letalidad.
AGRADECIMIENTOS
Por su apoyo inmensurable y colaboración: al Dr. Frank Lizarazo Cáparo, Decano de la Facultad de Medicina Humana de la Universidad de San Martin de Porres, al Dr. Benjamín Castañeda Castañeda, Director del Instituto de Investigación de la FMH-USMP, Dra. Berta Loja Herrera y Mg. Ángel Alvarado Yarasca, Centro de Investigación de Medicina Tradicional y Farmacología, y al Técnico Carlos Pante Medina, Bioterio de la FMH-USMP.
Expresamos también agradecimiento a la Sociedad Científica Médico Estudiantil Peruana (SOCIMEP) y al grupo CTO.
FINANCIAMIENTO
Co-financiamiento por: Facultad de Medicina Humana de la Universidad de San Martin de Porres, Sociedad Científica Médico Estudiantil Peruana (SOCIMEP), grupo CTO y los autores.
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CORRESPONDENCIA
Alberto Salazar Granara